Yılan zehiri, karboksil ester bağlarını hidrolize eden enzimler içerir.Hidroliz için substratlar fosfolipidler, asetilkolin ve aromatik asetattır.Bu enzimler üç tür içerir: fosfolipaz, asetilkolinesteraz ve aromatik esteraz.Yılan zehirindeki arginin esteraz da sentetik arginin veya lisini hidrolize edebilir, ancak esas olarak doğadaki protein peptit bağlarını hidrolize eder, bu nedenle proteaza aittir.Burada tartışılan enzimler sadece ester substratları üzerinde hareket eder ve herhangi bir peptit bağı üzerinde hareket edemez.Bu enzimler arasında asetilkolinesteraz ve fosfolipazın biyolojik fonksiyonları daha önemlidir ve tam olarak çalışılmıştır.Bazı yılan zehirleri, p-nitrofenil etil ester, a- veya P-naftalin asetat ve indol etil esteri hidrolize edebilen güçlü aromatik esteraz aktivitesine sahiptir.Biyolojik önemi bir yana, bu aktivitenin bağımsız bir enzim tarafından mı yoksa karboksilesterazın bilinen bir yan etkisi tarafından mı üretildiği hala bilinmiyor.Agkistrodon halys Japonicus zehiri, p-nitrofenil etil ester ve indol etil ester ile reaksiyona girdiğinde, p-nitrofenol ve indol fenolün hidrolizatları bulunamadı;Aksine, bu esterler kobra Zhoushan alt türü yılan zehiri ve Bungarus multicinctus yılan zehiri ile reaksiyona girerse, hızla hidrolize olurlar.Bu kobra zehirlerinin, yukarıdaki substratların hidrolizinden sorumlu olabilecek güçlü kolinesteraz aktivitesine sahip olduğu bilinmektedir.Aslında, Mclean ve ark.(1971), Cobra familyasına ait birçok yılan zehrinin indol etil ester, naftalin etil ester ve butil naftalin ester'i hidrolize edebildiğini bildirmiştir.Bu yılan zehirlerinin kaynağı: kobra, kara boyunlu kobra, kara dudaklı kobra, altın kobra, Mısır kobrası, kral kobra, altın kobra mamba, kara mamba ve beyaz dudaklı mamba (D. aw hala doğu rhombola çıngıraklı yılanını biliyor)
Yılan zehiri, serumdaki kolinesteraz aktivitesinin belirlenmesi için substrat olan metil indol etil ester'i hidrolize edebilir, ancak bu yılan zehiri kolinesteraz aktivitesi göstermez.Bu da kobra zehrinde kolinesterazdan farklı olarak bilinmeyen bir esteraz olduğunu göstermektedir.Bu enzimin doğasını anlamak için daha fazla ayırma çalışmasına ihtiyaç vardır.
1, Fosfolipaz A2
(I) Genel Bakış
Fosfolipaz, gliseril fosfatı hidrolize edebilen bir enzimdir.Doğada fosfolipaz A2 ve fosfolipaz olmak üzere 5 çeşit fosfolipaz vardır.
A. , fosfolipaz B, fosfolipaz C ve fosfolipaz D. Yılan zehiri esas olarak fosfolipaz A2 (PLA2) içerir, birkaç yılan zehiri fosfolipaz B içerir ve diğer fosfolipazlar esas olarak hayvan dokularında ve bakterilerde bulunur.Şekil 3-11-4, bu fosfolipazların substrat hidrolizi üzerindeki etki bölgesini göstermektedir.
Fosfolipazlar arasında PLA2 daha çok çalışılmıştır.Yılan zehirinde en çok çalışılan enzim olabilir.Substratı, Sn-3-gliserofosfatın ikinci pozisyonundaki ester bağıdır.Bu enzim yaygın olarak yılan zehri, arı zehiri, akrep zehri ve hayvan dokularında bulunur ve PLA2, dört familya yılan zehrinde bol miktarda bulunur.Bu enzim kırmızı kan hücrelerini parçalayıp hemolize neden olduğu için “hemolizin” olarak da adlandırılır.Bazı insanlar ayrıca PLA2 hemolitik lesitinaz olarak da adlandırılır.
Ludeeke, yılan zehrinin enzimler yoluyla lesitin üzerinde etki ederek hemolitik bir bileşik üretebileceğini ilk kez buldu.Daha sonra Delezenne ve ark.kobra zehrinin at serumu veya sarısına etki ettiğinde hemolitik bir madde oluşturduğunu kanıtladı.Artık PLA2'nin eritrosit zarının fosfolipidleri üzerinde doğrudan etki ederek eritrosit zarının yapısını bozduğu ve doğrudan hemolize neden olduğu bilinmektedir;Dolaylı hemoliz oluşturmak için kırmızı kan hücrelerine etki eden hemolitik lesitin üretmek için serum veya ilave lesitin üzerinde de etki edebilir.PLA2, dört yılan zehiri ailesinde bol miktarda bulunmasına rağmen, çeşitli yılan zehirlerindeki enzimlerin içeriği biraz farklıdır.çıngıraklı yılan (C
Yılan zehiri yalnızca zayıf PLA2 aktivitesi gösterdi.Tablo 3-11-11, Çin'deki 10 ana zehirli yılan zehrinin PLA2 aktivitesinin karşılaştırmasını göstermektedir.
Tablo 3-11-11 Çin'deki 10 yılan zehrinin fosfolipaz VIII aktivitelerinin karşılaştırılması
yılan zehiri
Yağ salınımı
alifatik asit,
Cjumol/mg)
Hemolitik aktivite CHU50/^ g * ml)
yılan zehiri
Yağ asitlerini serbest bırakın
(^raol/mg)
Hemolitik aktivite “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
onbir
Micracephal ofhis
beş nokta bir sıfır
Kalispallas
8. 68
iki bin sekiz yüz
gracilis
V, keskin
7. 56
* * #
ofiyofagus hannah
üç nokta sekiz iki
yüz kırk
Bnugarus factatus
7,56
iki yüz seksen
B. multicinctus
bir nokta dokuz altı
iki yüz seksen
Engerek bir russelli
yedi nokta sıfır üç
T, mukroskuamatus
bir nokta sekiz beş
Siamensis
T. stejnegeri
0.97
（2） Ayırma ve arınma
Yılan zehirindeki PLA2 içeriği büyüktür ve ısı, asit, alkali ve denatüranlara karşı kararlıdır, bu nedenle PLA2'yi saflaştırmak ve ayırmak kolaydır.Yaygın yöntem, önce ham zehir üzerinde jel filtrasyonu gerçekleştirmek, ardından iyon değiştirme kromatografisi yapmaktır ve bir sonraki adım tekrar edilebilir.İyon değiştirme kromatografisinden sonra PLA2'nin dondurularak kurutulmasının agregasyona neden olmaması gerektiğine dikkat edilmelidir, çünkü dondurarak kurutma prosesi genellikle sistemdeki iyonik kuvveti arttırır, bu da PLA2'nin agregasyonuna neden olan önemli bir faktördür.Yukarıdaki genel yöntemlere ek olarak, aşağıdaki yöntemler de benimsenmiştir: ① Wells ve ark.② Afinite kromatografisi için ligand olarak PLA2'nin substrat analoğu kullanıldı.Bu ligand, Ca2+ ile yılan zehirinde PLA2'ye bağlanabilir.EDTA çoğunlukla elüent olarak kullanılır.Ca2+ uzaklaştırıldıktan sonra PLA2 ile ligand arasındaki afinite azalır ve liganddan ayrılabilir.Diğerleri eluent olarak %30 organik solüsyon veya 6mol/L üre kullanır.③ Kardiyotoksin içindeki eser PLA2'yi çıkarmak için PheiiylSephar0SeCL-4B ile hidrofobik kromatografi yapıldı.④ Anti PLA2 antikoru, PLA2 üzerinde afinite kromatografisi yapmak için ligand olarak kullanıldı.
Şimdiye kadar çok sayıda PLAZ yılan zehri saflaştırıldı.Tu ve ark.(1977), 1975'ten önce yılan zehirinden saflaştırılan PLA2'yi listelemiştir. Son yıllarda, PLA2'nin ayrılması ve saflaştırılması hakkında her yıl çok sayıda makale rapor edilmektedir.Burada, PLA'nın Çinli bilim adamları tarafından ayrılmasına ve saflaştırılmasına odaklanıyoruz.
Chen Yuancong ve ark.(1981), izoelektrik noktalarına göre asidik, nötr ve alkalin PLA2'ye ayrılabilen Zhejiang'daki Agkistrodon halys Pallas zehirinden üç PLA2 türünü ayırdı.Toksisitesine göre, presinaptik nörotoksin Agkistrodotoksin olarak tanımlanan nötr PLA2 daha toksiktir.Alkalin PLA2 daha az toksiktir ve asidik PLA2'nin neredeyse hiç toksisitesi yoktur.Wu Xiangfu ve ark.(1984), moleküler ağırlık, amino asit bileşimi, N-terminal, izoelektrik nokta, termal stabilite, enzim aktivitesi, toksisite ve hemolitik aktivite dahil olmak üzere üç PLA2'nin özelliklerini karşılaştırdı.Sonuçlar, benzer moleküler ağırlığa ve termal kararlılığa sahip olduklarını, ancak diğer açılardan önemli farklılıklara sahip olduklarını gösterdi.Enzim aktivitesi açısından, asit enzim aktivitesi alkalin enzim aktivitesinden daha yüksekti;Alkali enzimin sıçan kırmızı kan hücreleri üzerindeki hemolitik etkisi en güçlüydü, bunu nötr enzim izledi ve asit enzim zorlukla hemolize oldu.Bu nedenle PLAZ'ın hemolitik etkisinin PLA2 molekülünün yükü ile ilgili olduğu tahmin edilmektedir.Zhang Jingkang ve ark.(1981) Agkistrodotoksin kristalleri yapmıştır.Tu Guangliang ve ark.(1983), izoelektrik noktası 7.6 olan toksik bir PLA'nın Fujian'dan Vipera rotundus zehirinden izole edildiğini ve saflaştırıldığını ve bunun fiziksel ve kimyasal özelliklerini, amino asit bileşimini ve N'deki 22 amino asit kalıntısının dizisini bildirmiştir. -terminal belirlendi.Li Yuesheng ve ark.(1985), Fujian'daki Viper rotundus zehirinden başka bir PLA2'yi izole etti ve saflaştırdı.PLA2*'nin alt birimi 13 800, izoelektrik noktası 10.4 ve spesifik aktivitesi 35/xnioI/miri mg'dir. Substrat olarak lesitin ile enzimin optimum pH'ı 8.0 ve optimum sıcaklık 65 °C'dir. LD5 farelere intravenöz olarak enjekte edildi.0,5 ± 0,12 mg/kg'dır.Bu enzimin belirgin antikoagülan ve hemolitik etkileri vardır.Toksik PLA2 molekülü, 18 çeşit amino asidin 123 kalıntısından oluşur.Molekül sistein (14), aspartik asit (14) ve glisin (12) açısından zengindir, ancak yalnızca bir metionin içerir ve N-terminali serin kalıntısıdır.Tuguang tarafından izole edilen PLA2 ile karşılaştırıldığında, iki izoenzimin moleküler ağırlığı ve amino asit kalıntılarının sayısı çok benzerdir ve amino asit bileşimi de çok benzerdir ancak aspartik asit ve prolin kalıntılarının sayısı biraz farklıdır.Guangxi kral kobra yılanı zehri zengin PLA2 içerir.Shu Yuyan ve ark.(1989), orijinal zehirden 3.6 kat daha yüksek spesifik aktiviteye, 13000 moleküler ağırlığa, 122 amino asit kalıntısından oluşan bir bileşime, 8.9 izoelektrik noktasına ve iyi termal stabiliteye sahip olan zehirden bir PLA2 izole etti.Temel PLA2'nin kırmızı kan hücreleri üzerindeki etkisinin elektron mikroskobuyla gözlemlenmesinden, insan kırmızı kan hücresi zarı üzerinde belirgin bir etkiye sahip olduğu, ancak keçi kırmızı kan hücreleri üzerinde belirgin bir etkisinin olmadığı görülebilir.Bu PLA2'nin insanlarda, keçilerde, tavşanlarda ve kobaylarda kırmızı kan hücrelerinin elektroforetik hızı üzerinde bariz bir geciktirici etkisi vardır.Chen ve ark.Bu enzim, ADP, kollajen ve sodyum araşidonik asit tarafından indüklenen trombosit agregasyonunu inhibe edebilir.PLA2 konsantrasyonu 10/xg/ml~lOOjug/ml olduğunda, trombosit agregasyonu tamamen inhibe edilir.Malzeme olarak yıkanmış trombositler kullanılmışsa, PLA2 20Mg/ml konsantrasyonunda agregasyonu engelleyememiştir.Aspirin, PLA2'nin trombositler üzerindeki etkisini engelleyebilen bir siklooksijenaz inhibitörüdür.PLA2, tromboksan A2'yi sentezlemek için araşidonik asidi hidrolize ederek trombosit agregasyonunu inhibe edebilir.Zhejiang Eyaletindeki Agkistrodon halys Pallas zehiri tarafından üretilen PLA2'nin çözelti yapısı, dairesel dikroizm, flüoresans ve UV absorpsiyonu yoluyla incelenmiştir.Deneysel sonuçlar, bu enzimin ana zincir konformasyonunun diğer tür ve cinslerden gelen aynı tür enziminkine benzer olduğunu, iskelet konformasyonunun iyi bir ısı direncine sahip olduğunu ve asit ortamındaki yapısal değişikliğin geri dönüşümlü olduğunu göstermiştir.Aktivatör Ca2+ ve enzim kombinasyonu, triptofan kalıntılarının ortamını etkilemezken, inhibitör Zn2+ tersini yapar.Solüsyonun pH değerinin enzim aktivitesini etkileme şekli yukarıdaki reaktiflerden farklıdır.
Yılan zehirinin PLA2 saflaştırılması sürecinde, bariz bir olgu, bir yılan zehirinin iki veya daha fazla PLA2 elüsyon tepe noktası içermesidir.Bu olgu şu şekilde açıklanabilir: ① izozimlerin varlığı nedeniyle;② Bir tür PLA2, çoğu 9 000~40 000 aralığında olan çeşitli moleküler ağırlıklara sahip çeşitli PLA2 karışımlarına polimerize edilir;③ PLA2 ve diğer yılan zehri bileşenlerinin kombinasyonu PLA2'yi zorlaştırır;④ PLA2'deki amid bağı hidrolize olduğu için yük değişir.① Ve ②, CrWa/w yılan zehirindeki PLA2 gibi yalnızca birkaç istisna dışında yaygındır.
İki durum vardır: ① ve ②.Üçüncü koşul PLA2'de aşağıdaki yılanların zehirlerinde bulunmuştur: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Filistin engerek, kum engerek ve korkunç çıngıraklı yılan km。.
Durum ④'nin sonucu, elektroforez sırasında PLA2'nin göç hızını değiştirir, ancak amino asit bileşimi değişmez.Peptitler hidroliz ile kırılabilir, ancak genellikle disülfür bağları ile birbirlerine bağlanırlar.Doğu çukur çıngıraklı yılanının zehiri, sırasıyla tip a ve tip p PLA2 olarak adlandırılan iki tür PLA2 içerir.Bu iki tip PLA2 arasındaki fark sadece bir amino asittir, yani bir PLA2 molekülündeki glutamin, diğer PLA2 molekülündeki glutamik asit ile yer değiştirir.Bu farkın kesin nedeni net olmamakla birlikte, genellikle PLA2'nin deaminasyonu ile ilgili olduğuna inanılmaktadır.Filistin engerek zehirindeki PLA2, ham zehirle sıcak tutulursa, enzim moleküllerindeki son gruplar eskisinden daha fazla olacaktır.C'den yılan zehirinden izole edilen PLA2'nin iki farklı N-terminali vardır ve moleküler ağırlığı 30000'dir. Bu fenomen, PLA2'nin doğu elmas sırtlı çıngıraklı yılanın zehirinde oluşturduğu simetrik dimere benzer olan PLA2'nin asimetrik dimerinden kaynaklanabilir. ve batı baklava sırtlı çıngıraklı yılan.Asya kobrası, bazıları sınıflandırmada çok kesin olmayan birçok alt türden oluşur.Örneğin, eskiden Cobra Outer Caspian alt türü olarak adlandırılan alt türler artık tanınmaktadır.
Dış Hazar Denizi Kobrasına atfedilmelidir.Pek çok alt türü olduğu ve birbirine karıştırıldığı için, yılan zehirinin bileşimi farklı kaynaklar nedeniyle büyük ölçüde değişir ve PLA2 izozimlerinin içeriği de yüksektir.Örneğin, kobra zehiri
R^ll türüne ait en az 9 çeşit PLA2 izozimine, Hazar kobra alt türü zehirinde ise 7 çeşit PLA2 izozimine rastlanmıştır.Durkin ve ark.(1981), 18 kobra zehiri, 3 mamba zehiri, 5 engerek zehiri, 16 çıngıraklı yılan zehri ve 3 deniz yılanı zehiri dahil olmak üzere farklı yılan zehirlerindeki PLA2 içeriğini ve izozim sayısını inceledi.Genel olarak, birçok izozim ile kobra zehirinin PLA2 aktivitesi yüksektir.Engerek zehirinin PLA2 aktivitesi ve izozimleri orta düzeydedir.Mamba zehiri ve çıngıraklı yılan zehirinin PLA2 aktivitesi çok düşüktür veya hiç PLA2 aktivitesi yoktur.Deniz yılanı zehirinin PLA2 aktivitesi de düşüktür.
Son yıllarda, doğu rhombophora çıngıraklı yılan (C. yılan zehiri, her ikisi de iki özdeş alt birimden oluşan tip a ve tip P PLA2 içerir) gibi, yılan zehirindeki PLA2'nin aktif dimer formunda var olduğu bildirilmemiştir. ve sadece dimeraz sahiptir
Aktivite.Shen ve ark.ayrıca yılan zehrinin PLA2'sinin sadece dimerinin enzimin aktif formu olduğunu öne sürdü.Uzamsal yapının incelenmesi, batı baklava sırtlı çıngıraklı yılanın PLA2'sinin dimer şeklinde var olduğunu da kanıtlıyor.balık yiyen bileşik
Yılan zehirinin iki farklı PLA ^ Ei ve E2'si vardır, burada 仏 dimer formunda bulunur, dimer aktiftir ve ayrışmış monomeri aktif değildir.Lu Yinghua ve ark.(1980), E. Jayanthi ve diğerlerinin fiziksel ve kimyasal özelliklerini ve reaksiyon kinetiklerini daha fazla inceledi.(1989), engerek zehirinden temel bir PLA2 (VRVPL-V) izole etti.Ölümcül, antikoagülan ve ödem etkileri olan PLA2 monomerinin moleküler ağırlığı 10000'dir.Enzim, PH 4.8 koşulu altında farklı moleküler ağırlıklara sahip polimerleri polimerize edebilir ve sıcaklık artışıyla polimerizasyon derecesi ve polimerlerin moleküler ağırlığı artar.96°C'de oluşan polimerin moleküler ağırlığı 53 100'dür ve bu polimerin PLA2 aktivitesi iki kat artar.
Gönderim zamanı: Kasım-18-2022